Микробиологический анализ

Микробиологический анализ почвы представляет собой комплексное исследование грунта с целью определить наличие, разновидности и численность микрофлоры, в т.ч. представителей основных групп почвенных микроорганизмов, грибов, бактерий, амеб, инфузорий, почвенных водорослей и др.

Анализ используется для оценки экологического состояния определенного участка земли. Может проводиться в рамках токсикологических, профилактических и санитарно-гигиенических исследований. Данный тип исследований регламентируется СанПиН 2.1.7.1287–03.

Кому требуется микробиологический анализ почвы?

Микробиологическое загрязнение почвы особенно велико в неканализованных землях и на территориях тех предприятий, где могут скапливаться органические отходы (например, бойни и т.

), на хозяйственных дворах, в животноводческих комплексах, на пляжах и прилегающих к ним участках. Со сточными водами микроорганизмы попадают в иловые осадки, а затем при использовании недостаточно обеззараженных иловых осадков и сточных вод на полях орошения может происходить инфицирование почвы, а затем ягодных культур и овощей, выращиваемых на таких полях. Бактерии, адсорбируясь на поверхности частиц и осадков сточных вод, могут некоторое время сохранять свою жизнедеятельность и вирулентность.

Микробиологический анализ почвы — это услуга, которая востребована в т.ч.:

Фермерскими хозяйствами, государственными и частными сельскохозяйственными предприятиями;
На хозяйственных дворах, в животноводческих комплексах;
На объектах, вблизи которых расположены свалки, выгребные ямы, полигоны и другие зоны повышенного риска;
Индивидуальными застройщиками, строительными компаниями при выборе подходящего земельного участка;
На территориях детских дошкольных учреждений, так как дети наиболее уязвимы для вредоносных бактерий различного рода;
На пляжах и прилегающих к ним участках, на землях под строительство объектов досуга;
Экологическими организациями и санитарно-эпидемиологическими службами;
Земельными комитетами, комиссиями по оценке пригодности земель к использованию для сельского хозяйства;

Данный вид исследования рекомендуется проводить в том случае, если в процессе эксплуатации участка предполагается прямой контакт с почвой.

Что оценивается с помощью микробиологического анализа почвы?

О возможности загрязнения почвы патогенными энтеробактериями свидетельствует индекс санитарно-показательных микроорганизмов БГКП (колиформ) и энтерококков 10 и более клеток/г почвы.

ОЦЕНКА СТЕПЕНИ ЭПИДЕМИЧЕСКОЙ ОПАСНОСТИ ПОЧВЫ Таблица 1

Категория загрязненности почв	Индекс БГКП	Индекс энтерококков	Патогенные бактерии, в т.ч. сальмонеллы	Яйца геогельминтов, экз./кг	Личинки — Л и куколки — К мух, экз. в почве с площадью 20 x 20 см
Чистая	1 — 10	1 — 10	0	0	0
Умеренно опасная	10 — 100	10 — 100	0	до 10	Л — до 10 К — отс.
Опасная	100 — 1000	100 — 1000	0	до 100	Л — до 100 К — до 10
Чрезвычайно опасная	1000 и выше	1000 и выше	0	> 100	Л > 100 К > 10

При необходимости углубленной оценки санитарного состояния почвы и способности ее к самоочищению исследуются показатели биологической активности почвы. Основными интегральными показателями биологической активности почвы являются: общая микробная численность (ОМЧ), клостридии, термофильные бактерии, грибы и актиномицеты, аммонификаторы, аэробные целлюлозные микроорганизмы и т.д.

Отбор проб почвы

Точечные пробы отбирают на пробной площадке из одного или нескольких слоев или горизонтов методом конверта, по диагонали или любым другим способом с таким расчетом, чтобы каждая проба представляла собой часть почвы, типичной для генетических горизонтов или слоев данного типа почвы. Количество точечных проб должно соответствовать ГОСТ 17.4.3.01-83.

Точечные пробы отбирают ножом или шпателем из прикопок или почвенным буром.

Объединенную пробу составляют путем смешивания точечных проб, отобранных на одной пробной площадке.

Для контроля загрязнения легко мигрирующими веществами точечные пробы отбирают по генетическим горизонтам на всю глубину почвенного профиля.

Для бактериологического анализа с одной пробной площадки составляют 10 объединенных проб. Каждую объединенную пробу составляют из трех точечных проб массой от 200 до 250 г каждая, отобранных послойно с глубины 0-5 и 5-20 см.

Пробы почвы, предназначенные для бактериологического анализа, в целях предотвращения их вторичного загрязнения следует отбирать с соблюдением условий асептики: отбирать стерильным инструментом, перемешивать на стерильной поверхности, помещать в стерильную тару.

Для гельминтологического анализа с каждой пробной площадки берут одну объединенную пробу массой 200 г, составленную из десяти точечных проб массой 20 г каждая, отобранных послойно с глубины 0-5 и 5-10 см. При необходимости отбор проб проводят из глубоких слоев почвы послойно или по генетическим горизонтам.

Пробы почвы, предназначенные для бактериологического анализа, упаковывают в сумки-холодильники и сразу доставляют в лабораторию на анализ. При невозможности проведения анализа в течение одного дня пробы почвы хранят в холодильнике при температуре от 4 до 5°С не более 24 ч.

При анализе на кишечные палочки и энтерококки пробы почвы хранят в холодильнике не более 3 сут.

Пробы почвы, предназначенные для гельминтологического анализа, доставляют в лабораторию на анализ сразу после отбора. При невозможности немедленного проведения анализа пробы хранят в холодильнике при температуре от 4 до 5°С.

Для исследования на яйца биогельминтов почву без обработки хранят не более7 сут., для исследования на яйца геогельминтов – не более 1 мес. При хранении проб для предотвращения высыхания и развития личинок в яйцах геогельминтов почву увлажняют и аэрируют один раз в неделю, для чего пробы вынимают из холодильника и оставляют на 3 ч при комнатной температуре, увлажняют водой по мере потери влаги и снова помещают для хранения в холодильник.

При необходимости хранения проб почвы более месяца применяют консервирующие средства: почву пересыпают в кристаллизатор, заливают раствором формалина с массовой долей 3%, приготовленным на изотоническом растворе натрия хлористого с массовой долей 0,85% (жидкость Барбагалло), или раствором соляной кислоты с массовой долей 3%, а затем ставят в холодильник.

Нормативные документы

ГОСТ 17.4.4.01-83 «Общие требования к отбору проб почвы»;
ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб»;
ГОСТ 17.4.4.02-84 «Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа»;
СанПиН 2.1.7.1287-03. «Почва, очистка населенных мест, бытовые и промышленные отходы, санитарная охрана почвы. Санитарно-эпидемиологические правила и нормы»;
МУ 2.1.7.730-99. «Гигиеническая оценка качества почвы населённых мест»;
МР ФЦ/4022 «Методы микробиологического контроля почвы».

prom-eco.ru

Рубрика	Биология и естествознание
Вид	научная работа
Язык	русский
Дата добавления	22.11.2009

Подобные документы

Гигиеническая характеристика физических факторов воздушной среды. Физические свойства атмосферного воздуха. Метеорологические факторы. Ионизация воздуха и атмосферное электричество. Изучение принципов гигиенического нормирования микроклимата помещений.

презентация [575,5 K], добавлен 05.12.2013
Состав и направления деятельности кафедры микробиологии и иммунологии. Принципы работы в микробиологической лаборатории. Подготовка посуды и инструментов. Техника отбора проб, посева и приготовления питательных сред. Методы идентификации микроорганизмов.

отчет по практике [28,8 K], добавлен 19.10.2015
Оборудование в микробиологической лаборатории. Оборудование рабочего стола. Мытье лабораторной посуды. Уборка помещений лаборатории. Техника взятия и доставки материала в микробиологическую лабораторию. Техника безопасности при работе в лабораториях.

курсовая работа [416,9 K], добавлен 01.10.2015
Питательные среды в микробиологии, их классификация и разновидности, сферы и особенности использования. Культивирование аэробных и анаэробных микроорганизмов. Методы количественного учета микроорганизмов, основные правила и условия хранения их культур.

реферат [24,6 K], добавлен 25.03.2013

Методы изучения морфологии микроорганизмов при микроскопии препаратов, приготовленных из чистых культур путем окрашивания. Способы витальной окраски микроорганизмов для избежания артефактов, появляющихся в результате токсического действия красителя.

презентация [3,4 M], добавлен 23.02.2016
Особенности микрофлоры воздуха и почвы, кожи и респираторного тракта. Санитарная оценка воздуха. Эпифитные микроорганизмы растений. Определение микробного числа. Аспирационный метод (с помощью аппарата Кротова). Седиментационный (чашечный) метод Коха.

презентация [1,8 M], добавлен 03.06.2014
Изучение морфолого-физиологических свойств чистых культур целлюлозолитических микроорганизмов. Изучение усвоения углеводов: сорбита, сахарозы, маннита, лактозы, мальтазы, глюкозы. Посев на среду Гисса. Методы выделения культуры бактерий из короедов.

реферат [1012,3 K], добавлен 11.03.2012
Санитарно-показательные микроорганизмы для почвы. Требования, предъявляемые к водопроводной воде. Микрофлора полости рта взрослого. Санитарно-гигиеническое состояние воздуха. Микроорганизмы промежности. Химические факторы, действующие на бактерии.

тест [29,4 K], добавлен 17.03.2017
Изучение особенностей строения и жизнедеятельности микробов. Характер взаимоотношений микроорганизмов с животным и растительным миром, который подразделяется на сапрофитов и паразитов. Внешние факторы воздействия на микроорганизмы и их изменение.

реферат [15,6 K], добавлен 24.11.2010

Основные методы вычленения и исследования эмпирического объекта. Наблюдение эмпирического научного познания. Приемы получения количественной информации. Методы, предполагающие работу с полученной информацией. Научные факты эмпирического исследования.

реферат [29,9 K], добавлен 12.03.2011

stud.wiki

Микробиологический анализ почвы: виды исследования

Различают несколько видов микробиологического анализа почвы:

базовый. Анализ по базовым бактериологическим характеристикам. В процессе этого исследования выявляется общее количество бактерий, наличие бактерий энтерококков, Cl.perfringens (пищевых токсикоинфекций), кишечной палочки и сальмонелл, нитрифицирующих и термофильных микроорганизмов. Анализ проводится в целях профилактики заражения. Объектом исследования выступают сельскохозяйственные земли, участки под индивидуальную застройку, земля под строительство объектов досуга и т.д. Исследование проводится на стадии выбора участка;

выявление нематод. Микробиологический анализ земли на определение нематод. Применяется для проверки сельскохозяйственных земель перед их использованием;

выявление паразитов. Исследование почвы на наличие паразитов (гельминтов). Проводится в целях профилактики на сельскохозяйственных землях, а также на участках, предназначенных для застройки, в том числе и строительства объектов досуга;

выявление патогенных микроорганизмов — сальмонелл, палочки вызывающей сибирскую язву, определение патогенных клостридий.

комплексный микробиологический анализ. Проводится в соответствии с расширенным списком санитарно-эпидемиологических характеристик. Регламентирующим документом в данном случае является СанПиН 2.1.7.1287-03. Проводится на территориях, предназначенных для объектов с высоким риском заражения — игровых площадок, скверов, пляжей, зон водоёмов, территорий дворов, лесопарков, детских школьных и дошкольных учреждений.

В ходе исследования определяется общее количество и процентное соотношение спор, аммонификаторов, грибов, сапрофитов, актиномицетов, аэробных бактерий. Выявляется также токсичность почвы.

Значение микробиологического анализа трудно переоценить. Он может помочь предотвратить сильные отравления и заражение тяжёлыми болезнями. Наиболее сложные случаи — это когда участок земли, который предполагается проверить, оказывается бывшим скотомогильником, свалкой органических отходов или территорией вредного производства.

Заказчики услуги

Анализ санитарно-бактериологических параметров почвы — это услуга, которая востребована фермерскими хозяйствами, государственными и частными сельскохозяйственными предприятиями. Она нужна индивидуальным застройщикам, строительным компаниям при выборе подходящего земельного участка. Используется также экологическими организациями и санитарно-эпидемиологическими службами. Заказчиками подобной услуги выступают земельные комитеты, комиссии по оценке пригодности земель к использованию для сельского хозяйства.

Кто имеет право на проведение микробиологического анализа почвы?

Подобные исследования имеют право проводить государственные лаборатории санитарно-эпидемиологической службы РФ, а также коммерческие организации, которые в установленном порядке прошли аккредитацию и соответствуют требованиям нормативных документов.

Исходные данные, необходимые для проведения исследования

Список маркеров, на которых основываются результаты, определяются в зависимости от целей исследования. Во всех случаях микробиологический анализ построен на сопоставлении концентрации термофильных бактерий и микроорганизмов, которые являются показателями фекального загрязнения.

К примеру, наличие в почве бактерий Streptococcus faecalis (стрептококков фекальных) или Е. coli (грамотрицательная кишечная палочка) говорит о свежем фекальном загрязнении. Присутствие таких микроорганизмов, как Clostridium perfringens (возбудитель токсикоинфекций), определяет давнее загрязнение. При выявлении БГКП (бактерий, принадлежащих к группе кишечной палочки) рассчитывается их количество в 1 грамме почвы. Кроме этого, исходными данными, которые необходимы для исследования, является общее количество в 1 грамме почвы сапрофитных, нитрифицирующих и термофильных бактерий.

Прямые и косвенные микробиологические показатели

Оценка состояния почвы по микробиологическим показателям осуществляется на основе информации, полученной при исследовании образцов почв. Пробы берутся в соответствии с регламентом работ. Как правило, объектом анализа выступают земельные участки с высоким риском контакта с патогенными микроорганизмами. Оценка производится по прямым и косвенным показателям.

Косвенные показатели определяют, насколько в этом месте почва подвержена биологической нагрузке. Это становится понятным после индикации микроорганизмов, которые называют санитарно-показательными: энтерококков и бактерий, относящихся к группе кишечной палочки. Нужно отметить, что индексы биологической нагрузки отличаются в зависимости от расположения места, где проводится анализ почвы. В крупных городах, где плотность населения очень высока, этот индекс наибольший.

Еще один «городской» признак загрязнённости почвы — высокое санитарное число, а также высокая динамика нитратов и аммиака. В совокупности это создает неблагоприятный фон и повышает риск инфицирования.

Прямые показатели при микробиологическом исследовании — это обнаружение энтеровирусов и патогенных энтеробактерий, которые являются причиной развития кишечных инфекций.

Этапы проведения работ

Первый этап исследования — определение расположения пробных площадок. Если рельеф местности неоднороден, то площадки подбираются по его элементам. В остальных случаях на каждые 100 квадратных метров закладывается одна площадка.

После разбивки участка и определения точек выборки из них изымаются пробы. Для этой цели делается шурф определённой глубины и размеров. Специалист, используя стерильный инструмент, срезает с одной из стенок шурфа образец почвы заданного размера и веса. С одной площадки берется 30 точечных проб, которые используются для 10 объединённых образцов.

Почва, которая была отобрана для проведения исследования, тщательно размельчается и просеивается: удаляются камни, корни и прочие посторонние включения. После этого в образцы добавляется водопроводная вода, и почва доводится до состояния суспензии.

Цель предварительной обработки исходного материала — извлечение микроорганизмов из частиц почвы. Для этой цели почвенные агрегаты разрушаются, что приводит к десорбции бактерий и других микроорганизмов с их поверхности. После того как образцы будут должным образом разведены, они используются для посева на питательные среды различного рода, а также для исследования путём прямой микроскопии.

Пример проведённого исследования

Объект анализа — детское дошкольное учреждение. Цель — проверка санитарного состояния почвы. Данный вид проверки проводится осенью и весной. Была произведена разбивка территории и определение пробных площадок размером 5 на 5 метров. Отбор проб производился с общей территории учреждения, из детских песочниц и игровых зон. Образцы почвы брались с глубины 0-10 сантиметров.

С песочниц, установленных в каждой из возрастных групп, были взяты объединённые пробы. Каждая из таких проб состояла из 10 точечных образцов. При сборе проб учитывалось расположение мест, которые с наибольшей вероятностью являются загрязнёнными.

После предварительной обработки образцы были подвергнуты лабораторному анализу. Результатом исследования стало отсутствие бактерий патогенного типа и индекс микроорганизмов, которые являются санитарными маркерами, до 10 клеток на 1 грамм почвы. Уровень патогенных энтерококков и энтеробактерий минимальный (4 клетки на 1 грамм почвы), яйца гельминтов отсутствуют.

Специфика проведения микробиологического анализа почвы

Важное условия для достоверности результатов исследования — чёткое выполнение правил асептики, в частности использование стерильных материалов, инструментов и тары при заборе проб почвы и её предварительной обработке. Срок хранения образцов от момента сбора до начала исследования — не более 1 суток.

Наибольшее количество бактерий и других микроорганизмов располагается в слое почвы на глубине 10–30 сантиметров. Почва с глубины более 1 метра малопригодна для целей микробиологического исследования — в ней можно выявить только единичные клетки микроорганизмов. Меньше всего клеток бактерий в почве, которая бедна органическими соединениями и влагой: менее 200 миллионов клеток в 1 грамме. Больше всего клеток в возделываемой почве: до 5 миллиардов в 1 грамме.

В большинстве случаев отбор почвы производится два раза в год — осенью и весной. В ходе определения месторасположения пробных площадок учитываются рельеф местности, условия землепользования, а также гидрологические условия местности.

Что влияет на стоимость проведения данного типа работ?

Стоимость исследования зависит от ряда факторов: площади земельного участка, поставленной задачи, особенностей объекта. Она также определяется типом анализа. Стоимость проверки по базовым бактериологическим характеристикам минимальная, а комплексного, детального исследования — максимальная. Кроме этого, имеет значение расположение участка, в частности его отдалённость.

Стоимость микробиологического анализа почвы в каждом случае рассчитывается индивидуально.

Перечень нормативных документов

Микробиологический анализ почвы проводится в соответствии с государственными стандартами, правилами, а также методическими рекомендациями, которые определяют технологию всех этапов исследования. Нормативные документы включают в себя правила определения и размеры пробных площадок, описание инструментов и методов сбора образцов. В них указаны требования к массе проб, условиям их транспортировки и хранения. Они определяют этапы предварительной подготовки образцов, методы анализа и критерии, по которым оцениваются полученные результаты.

экоизыскания.рф

Рыбные консервы должны быть промышленно-стерильными. Промышленная стерильность консервов означает отсутствие в продуктах микроорганизмов, способных развиваться при температурах хранения, установленных для данного вида консервов, и отсутствие в консервах микробиальных токсинов и микроорганизмов, опасных для здоровья потребителя.

В случаях, когда стерильность нарушается, консервы к реализации не допускается до получения результатов их микробиологического исследования. Если в стерилизованных консервах обнаружений непатогенные споро-образующие микробы, но отсутствует бомбаж и сохраняются свойственные качественному продукту органолептические показатели, то консервы могут быть реализованы.

При обнаружении в стерилизованных консервах неспорообразующих микробов (протей, кишечная палочка, стафилококк и т. п.) партия консервов подвергается дополнительному бактериологическому исследованию с отбором одной банки на каждые 500 банок из данной сменной выработки.

Когда число банок в партии 1000 и менее, то от каждой партии анализируют 3 банки. В случае неподтверждения анализа партия реализуется в обычном порядке.

В случае подтверждения бактериологического анализа вопрос о реализации данной партии консервов решается органами санитарно-эпидемиологической службы.

При выявлении палочки ботулизма Clostridium botulinum данная партия консервов считается непригодной к употреблению в пищу и уничтожается.

Возбудители ботулизма широко распространены в природе. Так, возбудители типа Е, характерные для рыбы, обитают в почве, прибрежном песке, морском иле. Палочка ботулизма развивается в анаэробных условиях при оптимальной температуре развития и образования токсинов 28—30⁼С (для типа Е). Токсины по силе действия превосходят все другие бактериальные яды.

Для проведения анализа на присутствие в продукте возбудителей ботулизма производится посев исследуемого продукта в жидкие питательные среды: пепсин-пептонную. казеиново-кислотную, казеиново-грибную, бульон Хоттингера. Посевы производят в 4 склянки со средами, предварительно прогретыми на кипящей водяной бане в течение 20 минут и затем охлажденными.

Одну склянку после посева прогревают при температуре 60°С в течение 15 минут, при этом погибают аэробы, вегетативные формы анаэробов, но сохраняются споры Cl. botulinum типа Е, погибающие при 80°С. Другую склянку прогревают при 80°С в течение 20 минут. Остальные 2 склянки не прогревают.

В посев, прогретый при температуре 60°С, и в один непрогретый добавляют трипсин — 0,1%, затем оба посева инкубируют в термостате при 29°С. В этих посевах определяется Cl. botulinum типа Е. Посев, прогретый при 80°С, и другой нег*рогретый инкубируют при 36°С. В них определяются возбудители ботулизма типа А, В и С, Вегетативные формы Cl. botulinum прорастают в непрогретых склянках, споры прорастут и в прогретых. Рост их сопровождается газообразованием. Из посевов готовят мазки и проводят микроскопию. Исследования проводят через сутки после посева; при отсутствии роста инкубацию продолжают до 10 суток. Cl. botulinum имеют вид палочек 0,6-0,9 на 4-9 мкм с закругленными концами, молодые клетки красятся по Граму положительно, старые. 4—5-суточные, — отрицательно.

Широко распространены в природе также бактерии группы протея, которые относят к условно-патогенным микроорганизмам. При попадании на

рыбу и рыбные продукты бактерии в благоприятных температурных условиях быстро размножаются, вызывая их гнилостную порчу, часто при этом в среде образуются токсичные амины и другие продукты распада. Сильно обсемененные протеями продукты содержат ядовитые вещества, кроме того, попадая в кишечник человека, бактерии еще больше размножаются, выделяя токсины. Появляются боли в животе, тошнота, рвота, повышение температуры (в течение 2—3 дней).

Протей размножается в аэробных условиях при оптимальной температуре 30—37^!С, погибает только после прогревания в течение 5 минут при 80^UC. Низкие температуры и замораживание практически не влияют на жизнеспособность бактерий.

Для обнаружения протея из исследуемого материала, растертого в ступке, делают посев петлей в конденсационную воду скошенного агара. Посевы инкубируют при температуре 37^JC. При наличии протея через 10—12 часов на поверхности агара появляется сплошной тонкий голубовато-серый налет, который микроскопируют.

Способностью вырабатывать токсины и вызывать пищевые отравления обладают также патогенные коагулазоположительные стафилококки, особенно золотистый стафилококк. Клинические признаки стафилококковых интоксикаций: короткий инкубационный период (2—3 часа), рвота, понос, слабость, боли в желудке. Температура обычно нормальная, выздоровление обычно наступает на следующий день. Источником обсеменения пищевых продуктов чаще всего являются животные и люди, больные гнойничковыми заболеваниями.

Энтеротоксин, продуцируемый стафилококками, разрушается только при стерилизации при температуре 120°С в течение 35 минут и после кипячения в течение 2 часов.

Стафилококк выдерживает высокие концентрации соли, но чувствителен к кислой реакции среды и к антибиотикам.

Обнаружить стафилококк в продукте можно посевом в жидкую питательную среду, например бульон с 10% хлористого, натрия. После инкубации в течение 1—2 суток производят высев на агар, а затем идентифицируют выросшие колонии по реакции плазмокоагуляции.

духа 75% в течение 45 дней, при температуре — 3—7°С майонез столовый и с пряностями — 30, с вкусовыми и желирующими добавками —20 дней.

Аджикуиспользуют как приправу для первых и вторых блюд, добавляют в маринады. Вырабатывают ее в Грузии. Получают из смеси разных пряностей: сухого молотого красного и острого стручкового перца, черного перца, лаврового листа и др.

Аджика представляет собой густую пасту или влажный порошок красновато-коричневого цвета. Вкус острожгучий. Расфасовывают по 200—500 г. Срок хранения не ограничен.

studopedia.ru

Почва

Она рассматривается учеными как один из возможных путей передачи инфекционных патологий. С выделениями больных людей или животных в почву проникают патогенные микроорганизмы. Некоторые из них, в частности, споровые, способны сохраняться в грунте продолжительное время (иногда несколько десятков лет). В почву попадают возбудители таких опасных инфекций, как столбняк, сибирская язва, ботулизм и пр. Методы санитарно-микробиологического исследования почвы позволяют определить «микробное число» (кол-во микроорганизмов в грамме грунта), а также коли-индекс (количество кишечных палочек).

Анализ грунта: общие сведения

К методам микробиологического исследования почвы следует в первую очередь отнести прямое микроскопирование и посев на плотную питательную среду. Популяции микроорганизмов и их группы, населяющие грунт, различаются по таксономическому положению и экологическим функциям. В науке они объединены под общим термином «почвенная биота». Грунт – среда обитания огромного числа микроорганизмов. В грамме почвы присутствует от 1 до 10 млрд их клеток. В этой среде активно протекает разложение органических веществ при участии разнообразных сапрофитных микроорганизмов.

Микроскопический метод микробиологического исследования: этапы

Анализ среды начинается с отбора образцов. Для этого используют предварительно очищенный и протертый спиртом нож (можно использовать лопату). После этого осуществляется подготовка образца. Следующий этап – подсчет клеток на окрашенных мазках. Рассмотрим каждую стадию в отдельности.

Отбор образцов

При анализе пахотной почвы, как правило, пробы берут с глубины всего слоя. Сначала удаляется 2-3 см сверху грунта, так как в нем может присутствовать посторонняя микрофлора. После этого с изучаемого участка грунта берут монолиты. Длина каждого из них должна соответствовать толщине слоя, из которого нужно взять образец.

На участке в 100-200 кв. м отбирается 7-10 проб. Вес каждой – порядка 0.5 кг. Пробы необходимо тщательно перемешать в мешке. После этого берут средний образец, весом приблизительно 1 кг. Его следует поместить в пергаментный (стерильный) пакет, вложенный в тканевый мешок. До непосредственного анализа образец хранится в холодильнике.

Подготовка к исследованию

Перемешанная почва высыпается на сухое стекло. Предварительно его необходимо протереть спиртом и обжечь над горелкой. При помощи шпателя почва тщательно перемешивается и раскладывается ровным слоем. В обязательном порядке необходимо удалить корешки, прочие посторонние элементы. Для этого используется пинцет. Перед работой пинцет и шпатель прокаливают над горелкой и остужают.

Из различных участков почвы, распределенной по стеклу, отбираются небольшие порции. Их взвешивают в фарфоровой чашке на технических весах. Обязательным этапом микроскопического метода микробиологического исследования является специальная обработка образца. Заранее необходимо подготовить 2 стерильные колбы. Их емкость не должна превышать 250 мл. В одну из колб наливают 100 мл водопроводной воды. Из нее берут 0.4-0.8 мл жидкости и увлажняют навеску почвы до пастообразного состояния. Смесь необходимо растереть пальцем или резиновым пестиком в течение 5 мин.

Водой из первой колбы почвенную массу переносят в пустую колбу. Далее ее снова растирают. После этого масса переносится в колбу возле пламени горелки. Емкость с почвенной суспензией встряхивают на качалке на протяжении 5 мин. После этого ее оставляют отстаиваться около 30 с. Это необходимо для того, чтобы крупные частицы осели. Через полминуты массу используют для приготовления препарата.

Подсчет клеток на фиксированных мазках

Прямое микроскопическое изучение грунта осуществляется по методу микробиологического исследования, разработанному Виноградским. В определенном объеме приготовленной суспензии подсчитывается число клеток микроорганизмов. Изучение фиксированных мазков позволяет сохранять препараты в течение длительного срока и выполнять подсчеты в любое удобное время.

Приготовление препарата осуществляется следующим образом. Определенный объем суспензии (как правило, 0.02-0.05 мл) наносится с помощью микропипетки на предметное стекло. К нему добавляют каплю раствора агар-агара (смеси полисахаридов агаропектина и агарозы, извлеченных из бурых и красных водорослей Черного моря), быстро перемешивают и распределяют на площади 4-6 кв. см. Мазок высушивается на воздухе и фиксируется 20-30 мин. спиртом (96 %). Далее препарат увлажняют дистиллированной водой, помещают в р-р карболового эритрозина на 20-30 мин.

После окрашивания его промывают и высушивают на воздухе. Подсчет клеток осуществляется с иммерсионным объективом.

Посев на плотные среды

Микроскопические методы микробиологического исследования позволяют выявить большое количество микроорганизмов. Но, несмотря на это, метод посева считается наиболее распространенным в практике. Суть его состоит в высеве объема препарата (почвенной суспензии) в чашке Петри на плотную среду.

Этот метод микробиологического исследования позволяет учитывать не только количество, но и групповой, а в ряде случаев и видовой состав микроскопической флоры. Подсчет числа колоний производится, как правило, со дна чашки Петри в проходящем свете. На подсчитанном участке ставится точка маркером либо чернилами.

Анализ воды

Микрофлора водного объекта, как правило, отражает микробный состав почвы около него. В этой связи методы санитарно-микробиологического исследования воды и почвы имеют особое практическое значение при изучении состояния конкретной экосистемы. В пресных водоемах содержатся, как правило, кокки, палочковидные бактерии.

Анаэробы в воде обнаруживаются в малом количестве. Как правило, они размножаются на дне водоемов, в иле, принимая участие в процессах очищения. Микрофлора океанов и морей представлена преимущественно солелюбивыми (галофильными) бактериями.

В воде артезианских скважин микроорганизмов практически нет. Это обуславливается фильтрующей способностью почвенного слоя.

Общепринятыми методами микробиологического исследования воды считаются определение микробного числа и коли-титра либо коли-индекса. Первый показатель характеризует количество бактерий в 1 мл жидкости. Коли-индекс представляет собой количество кишечных палочек, присутствующих в литре воды, а коли-титр – минимальное количество или максимальное разведение жидкости, в котором их еще можно обнаружить.

Определение микробного числа

Этот метод санитарно микробиологического исследования воды состоит в следующем. В 1 мл воды определяют количество факультативных анаэробов и мезофильных (промежуточных) аэробов, способных на мясопептонном агаре (основной питательной среде) при 37 град. на протяжении суток формировать колонии, видимые при увеличении в 2-5 р. или невооруженным глазом.

Ключевой стадией рассматриваемого метода микробиологического исследования воды является посев. Из каждой пробы делается посев не менее 2-х разных объемов. При анализе водопроводной воды в каждую чашку вносят по 1-0.1 мл чистой жидкости и по 0.01-0.001 мл загрязненной. Для посева 0.1 мл или меньшего объема жидкость разводится дистиллированной (стерильной) водой. Последовательно готовят десятикратные разведения. По 1 мл от каждого из них вносят в две чашки Петри.

Разведения заливаются питательным агаром. Его необходимо предварительно растопить и остудить до 45 град. После активного перемешивания среду оставляют на горизонтальной поверхности для застывания. При 37 град. посевы выращивают на протяжении суток. Рассматриваемый метод микробиологического исследования воды позволяет учитывать результаты на тех чашках, где количество колоний находится в пределах от 30 до 300.

Воздух

Он считается транзитной средой для микроорганизмов. Основными методами микробиологического исследования воздуха являются седиментация (оседание) и аспирация.

Микрофлора воздушной среды условно разделяется на переменную и постоянную. К первой относятся дрожжи, пигментообразующие кокки, спороносные бациллы, палочки и прочие микроорганизмы, устойчивые к высыханию, воздействию света. Представители переменной микрофлоры, проникая в воздух из привычной для них среды обитания, недолго сохраняют свою жизнеспособность.

В воздухе крупных мегаполисов микроорганизмов намного больше, чем в воздушной среде сельской местности. Над морями, лесами бактерий очень мало. Очищению воздуха способствуют осадки: снег и дождь. В закрытых помещениях микробов намного больше, чем на открытых пространствах. Их количество повышается в зимний период при отсутствии регулярного проветривания.

Седиментация

Этот метод микробиологического исследования в микробиологии считается простейшим. Он основывается на оседании капель и частиц на поверхности агара в открытой чашке Петри под действием силы тяжести. Метод седиментации не позволяет точно определить число бактерий в воздухе. Дело в том, что на открытой чашке уловить мелкие фракции пылевых частиц и бактериальных капель довольно сложно. На поверхности задерживаются преимущественно крупные частицы.

Этот метод не используется при анализе атмосферного воздуха. Этой среде свойственны большие колебания скорости движения воздушных потоков. Седиментация, однако, может использоваться при отсутствии более совершенных приборов или источника электроэнергии.

Определение микробного числа осуществляется по методу Омелянского. В соответствии с ним, за 5 минут на поверхности агара площадью 100 кв. см оседает такое число бактерий, которое присутствует в 10 л воздуха.

Приказ 535 «Об унификации микробиологических методов исследования»

Бактериологический анализ занимает важнейшее место в комплексе клинико-лабораторных мероприятий, направленных на диагностику, профилактику и лечение разнообразных инфекционных заболеваний. Однако исследованием окружающей среды они не ограничиваются.

Особое значение имеет бактериологический анализ биологического материала в лечебных учреждениях. К исследованиям, проводимым в медучреждениях, предъявляются повышенные требования. Целью Приказа «Об унификации микробиологических методов исследования» является совершенствование бактериологического анализа, повышение качества и эффективности микробиологической диагностики.

Микроскопическое исследование мазков у женщин

Оно является ключевым методом анализа при диагностике инфекций, передающихся половым путем, и оппортунистических заболеваний (вызываемых условно-патогенными бактериями).

Микроскопический анализ позволяет оценить качественный и количественный состав микрофлоры, проверить правильность взятия пробы. К примеру, наличие вагинального эпителия в мазке, взятом из цервикального канала, указывает на нарушение правил отбора биологической пробы.

Стоит сказать, что микробиологическое обследование в данном случае вообще сопровождается определенными проблемами. Они связаны с тем, что в нижних отделах полового тракта в норме присутствует разнообразная микрофлора, изменяющаяся в различные возрастные периоды. Для повышения эффективности исследования и были разработаны унифицированные правила.

Диагностика вирусных инфекций

Она осуществляется методами выявления РНК и ДНК-возбудителей. Они базируются преимущественно на определении нуклеотидных последовательностей в патологическом материале. Для этого используются молекулярные зонды. Они представляют собой искусственно полученные нуклеиновые кислоты, комплементарные (дополняющие) вирусным кислотам, меченные радиоактивной меткой или биотином.

Особенность метода состоит в многократном копировании конкретного фрагмента ДНК, включающего в себя несколько сотен (или десятков) нуклеотидных пар. Механизм репликации (копирования) заключается в том, что достраивание может начаться исключительно в определенных блоках. Для их создания используются праймеры (затравки). Они представляют собой синтезированные олигонуклеотиды.

ПЦР-диагностика (полимеразная цепная реакция) проста в исполнении. Этот метод позволяет быстро получить результат при использовании небольшого объема патологического материала. С помощью ПЦР-диагностики выявляются острые, хронические и латентные (скрытые) инфекции.

При чувствительности этот метод считается более предпочтительным. Однако в настоящее время тест-системы недостаточно надежны, поэтому ПЦР-диагностика не может полностью заменить традиционные методики.

fb.ru

Отбор проб для бактериологического анализа проводят сухим стерильным щупом в сухую стерильную стеклянную банку. Масса точечной пробы должна быть не менее 100 г. Масса объединенной пробы должна быть не менее 500 г.
Объединенную пробу тщательно перемешивают и делят пополам. Каждую часть упаковывают в стерильную стеклянную банку. Одну банку направляют в лабораторию, а другую сохраняют до окончания анализа.
Питательные среды, необходимые для анализа, готовят в соответствии с требованиями нормативной и технической документации.
Подготовка проб. От общей пробы берут навеску массой 50 г и помещают ее в стерильную колбу или стакан гомогенизатора с 450 см3 стерильного физиологического раствора, тщательно перемешивают в течение 30 мин и получают основное десятикратное разведение. После отстаивания в течение 10-15 мин из надосадочного слоя берут пипеткой 1 см3 жидкости, вносят в пробирку с 9 см3 стерильного физиологического раствора и получают стократное разведение. Аналогично готовят последующие разведения.
Определение присутствия бактерий группы кишечной палочки основано на их способности расщеплять маннит и лактозу, образовывать на средах ХБ и Хейфеца кислые продукты, которые изменяют цвет индикаторов, входящих в состав этих сред.
По 1 см3 каждого разведения вносят в пробирки, содержащие по 5 см3 одной из сред: Эйкмана, Кесслера, Булира, Хейфеца, ХБ или КОДА.
Посевы помещают в термостат при температуре 43°С для первых пяти сред и при 37°С для последней.
Через 24 ч учитывают рост на средах Эйкмана, Булира по помутнению и образованию газа, на средах Хейфеца, ХБ и КОДА — по изменению цвета.
Из пробирок, где наблюдается рост микробов, высеивают 0,1-0,2 см3 культуры на плотные дифференциально-диагностические среды (Эндо, Левина) и выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 ч.
Типичные колонии Е. coli имеют круглую форму, выпуклую или слегка приподнятую в центре поверхность, ровные края; цвет их розовый, красный или малиновый с металлическим блеском или без него на среде Эндо и фиолетовый или черный — на среде Левина.
Выросшие изолированные колонии (не менее 4) пересевают в мясо-пептонный бульон, выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 ч.
После этого одну часть пробирок используют для приготовления мазков, посева на дифференциально-диагностические среды, заражения мышей, вторую — для приготовления инактивированного антигена.
Изучают морфологические, биохимические и патогенные свойства выделенных культур в целях проведения их идентификации.
Определение бактерий из рода сальмонелл основано на выявлении их характерного роста на селективных средах и установлении ферментативных и серологических свойств.
Навеску массой 50-200 г помещают в колбу, содержащую одну из сред предварительного обогащения (физиологический раствор, пептонная вода), в соотношении 1:5. Содержимое колбы тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре 37°С. Через 16-18 ч производят посевы на любые две основные среды обогащения (селенитовый бульон, магниевая среда, среды Киллиана, Мюллера, Кауфмана) в соотношении 1:5. Культивируют при температуре 37°С.
Через 16-18 ч из обогатительных сред производят посевы на чашки с твердыми дифференциально-диагностическими средами (висмут-сульфит агар, среды Плоскирева или Левина), которые помещают в термостат при температуре 37°С. Чашки просматривают через 24-48 ч.
На висмут-сульфит S. typhi, S. paratyphi А растут в виде мелких, нежных серовато-зеленых колоний с черным центром; S. Cholerae suis — в виде зеленых колоний.
Колонии почти всех других видов сальмонелл значительно крупнее, темно-коричневого цвета с металлическим блеском, окруженные светлым ореолом, цвет участка среды под колонией — черный.
На среде Плоскирева сальмонеллы растут в виде прозрачных или нежно-розовых колоний, на среде Левина — в виде прозрачных, бледных, нежно-розовых или розовато-фиолетовых колоний.
При обнаружении колоний, подозрительных на сальмонеллы, 3-5 из них пересевают на комбинированные среды.
Культуры грамотрицательных подвижных палочек, ферментирующих глюкозу с образованием газа, не ферментирующих лактозу и сахарозу, не разлагающих мочевину и не образующих индол, подвергают серологическому исследованию в реакции агглютинации на стекле с поливалентной адсорбированной 0-сывороткой.
Обнаружение подвижных грамотрицательных палочек (кроме S. pullorum, S. gallinarum), дающих характерный рост на селективных средах, не ферментирующих лактозу и сахарозу, ферментирующих глюкозу и маннит с образованием кислоты и газа (S. typhi suis не ферментирует маннит), дающих положительную реакцию агглютинации с поливалентной адсорбированной 0-сывороткой, указывает на наличие бактерий из рода сальмонелл.
Определение анаэробных бактерий основано на их способности расти в отсутствие кислорода, на морфологических особенностях, росте на селективных питательных средах, на выявлении патогенности возбудителей путем заражения лабораторных животных.
В пробирки со средами Китта — Тароцци и Вильсона — Блера и в чашки с кровяным агаром по Цейслеру вносят по 1 см3 первых трех разведений испытуемой взвеси, помещают в термостат и инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 ч.
Почернение среды Вильсона — Блера, а также быстрое начало роста на среде Китта — Тароцци при обильном газообразовании является характерным для Clostridium perfringens. На кровяном агаре через 24 ч поверхность колоний С, perfringens слегка выпуклая, округлая или продолговатая, колонии сочные от серого до зеленого цвета, окруженные большой зеленовато-коричневой зоной гемолиза. В мазках, приготовленных из колоний, выросших на кровяном агаре, хорошо выражены капсулы и центрально расположенные крупные овальные споры, ширина которых превышает ширину палочки. Биологическую пробу проводят на морских свинках и белых мышах путем внутрибрюшиного заражения двухсуточной бульонной культурой. При положительном результате подопытные животные гибнут через 2-3 сут.
Рост С. botulinum наблюдается на вторые-третьи сутки и характеризуется помутнением среды Китта — Тароцци, образованием осадка и запахом прогорклого масла. При исследовании на наличие токсина берут навеску продукта массой не менее 50 г, помещают в колбу со стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:4. Подготовленный материал настаивают в течение 2-3 ч, затем центрифугируют и супернатантом заражают животных внутрибрюшинно или подкожно: морских свинок — в дозе 1-2 см3, белых мышей — в дозе 0,2-0,3 см3. Контрольным животным вводят центрифугат, инактивированный на водяной бане при температуре 100°С в течение 30 мин, в тех же дозах.
Биопробу считают положительной, если подопытные животные погибают в течение 2 сут после введения им центрифугата, не подвергнутого кипячению.

agro-archive.ru

Материалы, подлежащие бакобследованию, собирают в стерильную посуду, сопровождают этикеткой с фамилией обследуемого и наименованием материала. В сопроводительном документе (направлении) необходимо указать, какое отделение направляет материал, Ф.И.О. и возраст больного, предполагаемый диагноз, антибактериальную терапию, дату и час взятия пробы.

Материал доставляется в контейнерах, исключая их опрокидывание. При транспортировке не допускаются смачивание ватных пробок и замораживание материала. Материал доставляется в течение 1—2 ч после взятия. При невозможности доставки в указанные сроки биоматериал хранят в холодильнике (кроме крови и материала, исследуемого на наличие менингококка). При увеличении времени доставки проб до 48 ч необходимо использовать транспортные среды.

Методики взятия проб должны быть описаны микробиологом в специальной инструкции. Сотрудники лаборатории проводят первоначальную подготовку всего персонала по соблюдению взятия проб.

Доставленные в лабораторию пробы должны быть размещены в специально отведенном для приема биоматериала месте. На работников лаборатории при приеме возлагается контроль за соблюдением правильной доставки образцов. Категорически запрещается доставка материала в лабораторию обследуемыми лицами.

В случае несоблюдения условий образцы не подлежат обработке — об этом сообщается лечащему врачу, а исследования проводят повторно.

Общие требования к процедуре отбора и транспортировки проб:

• знание оптимальных сроков для взятия материала на исследование;

• взятие материала с учетом места максимальной локализации возбудителя путем его выделения в окружающую среду;

• отбор материала для исследования в необходимом и достаточном объеме с обеспечением условий, исключающих контаминацию проб;

• по возможности взятие материала до применения антибиотиков и других химиотерапевтических препаратов или после отмены антибиотиков через 2—3 дня.

Микробиологическое исследование крови

Процедурная сестра или лаборант осуществляют взятие крови у больного в процедурном кабинете или в палате — в зависимости от состояния больного. Кровь для посева рекомендуется брать до начала антибиотикотерапии или через 12—24 ч после последнего введения препарата больному.

Посев проводится во время подъема температуры. Кровь рекомендуется брать 2—4 раза в сутки, при остром сепсисе — 2—3 взятия из различных мест в течение 10 минут. При наличии у больного постоянного подключичного катетера или системы в вене можно воспользоваться ими для получения крови только в течение 3 дней, так как наступает контаминация катетера. Небольшому количеству крови дают свободно стечь в пробирку, затем в шприц набирают кровь для посева. Посев крови производят над спиртовкой.

Кровь берется у взрослых в количестве 5—20 мл, а у детей — 1—15 мл, из шприца без иглы над спиртовкой засевается во флаконы с питательной средой в соотношении крови и среды 1:10. Флаконы с кровью доставляются в лабораторию немедленно.

Микробиологическое исследование мочи

Исследуют, как правило, утреннюю порцию мочи. До взятия проводят туалет наружных половых органов. При мочеиспускании первая порция мочи не используется. Во втором мочеиспускании, начиная с его середины, моча собирается в стерильную посуду в количестве 3—10 мл, плотно закрывается стерильной пробкой. Желательно доставлять пробы мочи в лабораторию немедленно. При отсутствии такой возможности моча может храниться при комнатной температуре 1—2 ч, но не более 24 ч (при температуре 4 °С) после взятия.

Микробиологическое исследование кала

При инфекционных заболеваниях (тифопаратифозных, ОКИ, дизентерии) и внутрибольничных инфекциях желудочно-кишечного тракта материал берется с первых часов и дней поступления больного до начала антибиотикотерапии. Взятие образцов производится минимум 2 раза.

Испражнения для посева берут сразу после дефекации. Сбор осуществляется из судна, горшка, пеленки, которые предварительно тщательно дезинфицируются и многократно отмываются горячей водой. Из посуды кал забирают стерильным шпателем или палочкой в стерильные банки с крышкой, пробирки. В отбираемые пробы включают патологические примеси (гной, слизь, хлопья). При невозможности получения испражнений материал берется непосредственно из прямой кишки с помощью ректальных тампонов. Тампон смачивают в физрастворе и вводят на 8—10 см, а затем помещают в стерильные пробирки. Кал доставляют в лабораторию не позднее 1—2 ч после сбора. Материал может сохраняться при температуре 2—6 °С в течение 24 ч.

Микробиологическое исследование спинномозговой жидкости

Взятие ликвора желательно проводить до начала антибиотикотерапии — в стерильную пробирку с крышкой в количестве 1—3 мл. Материал доставляют в лабораторию, где тотчас, пока ликвор теплый, его подвергают анализу. При отсутствии такой возможности ликвор можно хранить при температуре 37 °С в термостате в течение 2—3 ч.

Во время транспортировки ликвор тщательно предохраняют от охлаждения, используя грелки, термос.

Микробиологическое исследование гноя, биоптата стенок абсцесса

Исследуемый материал в максимальном количестве берется стерильным шприцем и в нем же с закрытой иглой доставляется в лабораторию немедленно либо может храниться в холодильнике в течение 2 ч.

Микробиологическое исследование мокроты

Больной перед откашливанием чистит зубы, полощет рот и горло кипяченой водой. Мокроту собирают в стерильную банку или флакон с крышкой; если она отделяется плохо, рекомендуется накануне назначить отхаркивающие или больному дают вдохнуть 25 мл 3— 10%-ного физраствора через распылитель.

Мокрота может храниться в течение 2 ч при комнатной температуре и в течение 24 ч — в холодильнике. При сборе мокроты больной не должен смешивать во рту слизь и слюну. Мокрота, состоящая из слюны и частиц пищи, не исследуется.

Микробиологическое исследование носоглоточной слизи, гнойного отделяемого миндалин, отделяемого из носа

Взятие материала проводится натощак или не ранее чем через 2—4 ч после еды. Корень языка придавливают шпателем. Материал берут стерильным тампоном, не касаясь языка, слизистой щек и зубов.

При исследовании носоглоточной слизи на менингококк пользуются изогнутым стерильным ватным тампоном. Его вводят концом кверху за мягкое нёбо в носоглотку и проводят 3 раза по задней стенке. У больных ангинами при подозрении на дифтерию материал берут с миндалин сухим тампоном, при наличии налетов — следует брать с границы здоровых и пораженных тканей, слегка нажимая на них тампоном. Материал на сухих тампонах доставляется в лабораторию в течение 2 ч в сумках с грелками.

При коклюше и паракоклюше исследуют носоглоточную слизь, носоглоточный смыв, транстрахельные аспираты. Фиксируя голову пациента, вводят тампон в ноздрю до самых хоан и оставляют там на 15—30 с, затем вынимают и помещают в стерильную пробирку. При сборе материала изо рта тампон вводят за мягкое нёбо, стараясь не задеть язык и миндалины. Снимают слизь с задней стенки глотки, осторожно вынимают тампон, который помещают в стерильную пробирку.

При сборе материала на питательные среды материал получают, подставляя больному вертикально во время кашля чашку Петри со средой и держа ее на расстоянии 5—10 см в течение нескольких секунд, чтобы уловить 5—6 кашлевых толчков. Чашку с посевом быстро закрывают крышкой, заворачивают в бумагу и вату. Материал доставляют в лабораторию немедленно при температуре 22—37 °С. В зимнее время в контейнер помещают грелки (35—40 °С). Хранение материала возможно при температуре 37 °С в течение 2—3 ч.

medn.ru

Особенностью окраски по методу Грама является неодинаковое отношение различных микробов к красителям трифенилметановой группы: генцианвиолету, метилвиолету, кристалвиолету. Микробы, входящие в группу грамположительных дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. Окрашенные микробы не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином грамположительные микробы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Грамотрицательные микроорганизмы образуют с генциан-, кристалл- или метилвиолетом и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет. Отношение микроорганизмов к окрашиванию по Грамму имеет большое диагностическое значение.

Подготовка микробной культуры

Небольшое количество почвенной пробы следует высеять в чашки Петри с водорослевым агаром с помощью микробиологической петли, далее засеянные чашки Петри нужно выдержать при комнатной температуре в течение 9 дней. Также лучше сделать контрольный посев из воздуха, чтобы позже сравнить колонии микрооганизмов, выросших в разных чашках Петри, и знать какие микроорганизмы могли попасть из воздуха, а не из почвы.

Приготовление мазка

На чистое, обезжиренное предметное стекло поместить каплю дистиллированной воды, затем с помощью микробиологической петли в неё внести небольшое количество выросшей на агаре микробной культуры. Далее нужно сделать мазки и фиксировать их на пламени. Лучше сделать по 2-3 мазка на каждый образец почвы и один контрольный мазок.

Окрашивание микроорганизмов

Окраску микроорганизмов по Граму следует производить следующим образом:

Мазок, фиксированный на огне, нужно окрашивать через фильтровальную бумагу основным красителем- раствором основного карболового кристалвиолета. Прокрашивание должно длиться 1-2 минуты.
Далее бумагу следует снять, избыток краски слить и налить раствор Люголя на 1-2 минуты до почернения препарата.
Далее раствор Люголя нужно опять слить, предметное стекло для обесцвечивания мазка погрузить несколько раз в стаканчик со спиртом; процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости.
Затем препарат следует тщательно промыть водопроводной водой и докрасить спиртово-водным раствором фуксина в течение двух минут.
В конце мазок нужно промыть водой и высушить.

Результат окраски: грамположительные бактерии окрашиваются основной краской в темно- фиолетовый цвет, грамотрицательные бактерии, воспринимая дополнительную окраску, приобретают ярко-малиновый цвет.

ru-wiki.org